2021年1月17日 星期日

Nat Comm | 陈雷研究组报道NALCN-FAM155A亚通道复合体的高分辨结构

      钠通道NALCN复合体主要位于神经元细胞膜上,介导了电压调控、胞外钙离子阻塞的钠漏电流,使静息电位偏向于去极化,从而提高神经细胞的兴奋性(1-4)。NALCN通道亚基在哺乳动物中高度保守,与电压门控钙离子通道(CaV)和电压门控钠离子通道(NaV)具有一定的同源性。NALCN的功能异常会导致多种严重的神经疾病(5),例如:患有精神运动发育迟缓和特征面相的小儿肌张力低下(IHPRF)(6,7)、四肢和面部先天性挛缩、肌张力低下和发育迟缓(CLIFAHDD)(8)等。除此之外,也有报道显示NALCN参与了呼吸节律(1)、痛觉感知(9)、生物钟(10)和快速动眼睡眠(11)等重要的生物学过程。

 

尽管NALCN通道有着如此重要的功能,但其工作机制仍不清楚。有报道显示在HEK293和爪蟾卵母细胞等异源体系中,只有共同表达NALCNFAM155UNC79UNC80四个亚基,才能测量到典型的钠漏电流(2)。其中,NALCN是孔道形成亚基(1,2);FAM155是跨膜调控亚基,协助NALCN上膜(12);而UNC79UNC80是分子量巨大(300 kD370 kD)且功能尚不清楚的调控亚基(2,4)。

2020123日,陈雷研究组在 Nature Communications 杂志上报导了哺乳动物NALCN-FAM155A亚通道复合体的高分辨结构。本项研究使用单颗粒冷冻电镜技术来探究NALCN的工作机制。由于NALCN-FAM155-UNC79-UNC80四元复合体不够稳定,作者在此聚焦于较稳定的NALCN-FAM155核心亚复合体的结构解析。经过同源蛋白筛选等步骤,作者确定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A亚基组成的复合体为研究对象,并在克服了样品制备、数据处理等困难后,通过单颗粒冷冻电镜技术获得了2.65 Å高分辨率的NALCN-FAM155A复合体的电子密度,并根据同源蛋白结构搭建了原子模型。

结构显示NALCN整体结构与CaVNaV的结构类似,由四个同源但不相同的重复结构域(DI-DIV)组成,每个重复含有6个跨膜螺旋(S1-S6),其中位于中心的S5-S6形成了孔道区,而位于四周的S1-S4组成了电压感受结构域(VSD)。胞外FAM155A的半胱氨酸富集结构域(CRD)像盖子一样盖在NALCN孔道结构域的顶端,并与NALCN的胞外loop有着复杂而紧密的相互作用。此外,NALCNC端结构域(CTD)与III-IV螺旋(III-IV linker)及DII-DIII间的CTD相互作用螺旋(CIH)共同组成了胞内结构域(图1)。

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1NALCN-FAM155A亚复合体的结构

通过计算离子通过的路径,作者发现NALCN胞外孔道区周围的氨基酸带有较多负电,利于吸引胞外钠离子并排斥阴离子。而计算出的孔道半径显示孔道区在两个地方收缩的很紧,一个是靠近胞内的疏水的,最小半径小于1 Å,表明通道处于关闭状态;另一个是靠近胞外的离子选择过滤器,负责选择性地通透钠离子。序列比对的结果显示NALCN的离子选择过滤器由“EEKE”组成,不同于NaV“DEKA”CaV1.1“EEEE”。高分辨率的电子密度显示NALCN第四个结构域的选择过滤氨基酸E1389有两种构象,但均不位于选择过滤器的高场强(HFS)层,从而导致在HFS层,NALCNNaV的电荷分布相似,均为−− + 0,这可能解释了NALCN为何对钠离子有更高的选择性(图2)。此外,有研究表明:相比于E1389D1390对于胞外钙离子阻塞NALCN的电流更加重要2,这也与所观测到的结构相吻合。

 

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2NALCN孔道区的结构

 

NALCN通道复合体的电流也受到电压调控,其中电压感受结构域VSD扮演着重要角色。VSD发挥功能依赖于其内部的电荷转移中心(CTC)和S4上连续的带正电的氨基酸(R1-R6)。CTC主要由S2上一个芳香族氨基酸及间隔开的两个带负电的氨基酸(E1-F3-E4)和S3上相邻的负电氨基酸组成。相比NaVCaV等电压门控离子通道,NALCNVSD发生了不同程度的退化。根据序列比对和结构比较,可以发现NALCNVSDIVSDII有着完整的CTCS4上的正电氨基酸簇;而VSDIIICTC并不完整,缺少S2上关键的芳香族氨基酸;VSDIV虽然有着完整的CTC,但S4仅仅只有两个带正电的氨基酸(图3)。先前的研究结果表明VSDIVSDIIS4上的正电氨基酸对于NALCN的活性至关重要,而VSDIIIVSDIVS4上的正电氨基酸则可有可无2,这与所观测到的结构一致。

 

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3NALCN电压感受结构域的结构

 

综上所述,本项研究通过结构生物学技术,观测到了哺乳动物NALCN-FAM155A亚复合体的高分辨结构,为深入理解NALCN的钠离子选择性、胞外钙离子阻塞和电压调节特性等奠定了基础。

 

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-020-20002-9

 

 

 

参考文献

 

(1) Lu, B. et al. The neuronal channel NALCN contributes resting sodium permeability and is required for normal respiratory rhythm. Cell 129, 371-383, doi:10.1016/j.cell.2007.02.041 (2007).

 

(2) Chua, H. C., Wulf, M., Weidling, C., Rasmussen, L. P. &Pless, S. A. The NALCN channel complex is voltage sensitive and directly modulated by extracellular calcium. Science Advances 6, eaaz3154, doi:10.1126/sciadv.aaz3154 (2020).

 

(3) Lu, B. et al. Peptide neurotransmitters activate a cation channel complex of NALCN and UNC-80. Nature 457, 741-744, doi:10.1038/nature07579 (2009).

 

(4) Lu, B. et al. Extracellular calcium controls background current and neuronal excitability via an UNC79-UNC80-NALCN cation channel complex. Neuron 68, 488-499, doi:10.1016/j.neuron.2010.09.014 (2010).

 

(5) Bramswig, N. C. et al. Genetic variants in components of the NALCN-UNC80-UNC79 ion channel complex cause a broad clinical phenotype (NALCN channelopathies). Human genetics 137, 753-768, doi:10.1007/s00439-018-1929-5 (2018).

 

(6) Al-Sayed, M. D. et al. Mutations in NALCN cause an autosomal-recessive syndrome with severe hypotonia, speech impairment, and cognitive delay. American journal of human genetics 93, 721-726, doi:10.1016/j.ajhg.2013.08.001 (2013).

 

(7) Köroğlu, Ç., Seven, M. &Tolun, A. Recessive truncating NALCN mutation in infantile neuroaxonal dystrophy with facial dysmorphism. Journal of medical genetics 50, 515-520, doi:10.1136/jmedgenet-2013-101634 (2013).

 

(8) Chong, J. X. et al. De novo mutations in NALCN cause a syndrome characterized by congenital contractures of the limbs and face, hypotonia, and developmental delay. American journal of human genetics 96, 462-473, doi:10.1016/j.ajhg.2015.01.003 (2015).

 

(9) Eigenbrod, O. et al. Rapid molecular evolution of pain insensitivity in multiple African rodents. Science (New York, N.Y.) 364, 852-859, doi:10.1126/science.aau0236 (2019).

 

(10) Flourakis, M. et al. A Conserved Bicycle Model for Circadian Clock Control of Membrane Excitability. Cell 162, 836-848, doi:10.1016/j.cell.2015.07.036 (2015).

 

(11) Funato, H. et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature 539, 378-383, doi:10.1038/nature20142 (2016).

 

(12) Xie, L. et al. NLF-1 delivers a sodium leak channel to regulate neuronal excitability and modulate rhythmic locomotion. Neuron 77, 1069-1082, doi:10.1016/j.neuron.2013.01.018 (2013).

 

(13) Kschonsak, M. et al. Structure of the human sodium leak channel NALCN. Nature 587, 313-318, doi:10.1038/s41586-020-2570-8 (2020).

 

(14) Xie, J. et al. Structure of the human sodium leak channel NALCN in complex with FAM155A. Nat Commun 11, 5831, doi:10.1038/s41467-020-19667-z (2020).