2020年5月26日 星期二

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       "眼见为实"。超分辨荧光成像技术的出现极大地推动了现代生命科学对细胞内新结构和新的动态过程的研究。然而,超分辨荧光成像技术存在两个局限:一是尽管陈良怡课题组之前发展的海森结构光超分辨率显微镜(https://www.nature.com/articles/nbt.4115 )已经将荧光超分辨率成像的光照度降低到W/mm2的数量级,三维超分辨率成像仍然是一个瓶颈;再者,荧光成像最大的缺陷是在于只能看见细胞内所标记的分子,无法像电子显微镜那样同时看到细胞整体的全貌。另一方面,无标记成像通过细胞内不同结构表现出的不同光学属性来进行成像。新近出现的光学衍射层析成像通过结合断层扫描及全息显微成像技术,可在衍射模型下实现三维无标记成像。但先前的工作主要关注于提高光学衍射层析成像分辨率的,忽略较慢的成像速度在活细胞成像中会造成实际分辨率下降。同时,无标记成像如果没有分子特异性的荧光成像的辅助,其结果也无法得到验证和解释,不产生对生物学家来说有意义的数据。

      近日,陈良怡组发表合作文章,将三维无标记光学衍射层析显微成像与二维海森结构光超分辨荧光成像技术相结合,发展了双模态超分辨率显微镜,命名为超分辨荧光辅助衍射层析(SR-FACT)双模态显微成像技术,实现了对细胞内细胞器相互作用过程的高速三维全景成像。相关成果以 Super-resolution fluorescence-assisted diffraction computational tomography reveals the three-dimensional landscape of the cellular organelle interactome 在线发表在Light: Science & Applications上。

        在这项研究中,研究团队集成了三维光学衍射层析显微成像模态与海森二维结构光照明荧光成像模态,实现了对活细胞的快速、长时程双模态成像。在三维光学衍射层析成像模态中,研究团队发展了新的波矢迭代算法以修正高速的照明光断层扫描中出现的误差,以在保证高速成像的同时保持成像系统中充足的光子通量,从而有效提高了高速成像过程中的灵敏度,可以200 nm横向分辨率对40×40×20 μm3的三维视场以0.8 Hz速度成像。而对于超分辨荧光成像模态,研究团队选择了相比传统结构光照明荧光显微镜更加节约光子数的海森二维结构光荧光显微镜来辅助光学衍射层析模态进行分子特异性表征,其横向分辨率可达100 nm。利用这一双模态成像系统,研究团队成功对活细胞内六种主要细胞器进行了共定位成像,并展示了其在研究细胞器相互作用中的独特优势。 SR-FACT双模态成像系统的硬件实现、算法流程及分辨率表征

图1. SR-FACT双模态成像系统的硬件实现、算法流程及分辨率表征

     应用SR-FACT,他们证明不需要标记就可以同时高速三维成像活细胞内线粒体、脂滴、核膜、染色体、内质网及溶酶体等多种细胞器的结构、动态以及相互作用的全景图。

六种细胞器在SR-FACT下的共定位成像结果 图2. 六种细胞器在SR-FACT下的共定位成像结果

      研究团队还观察到了一种新的中性酸碱度的低折射率囊泡结构,并通过长达小时量级的连续成像揭示了其生成和命运路径及组织细胞器相互作用的枢纽功能,命名为"黑色液泡小体(dark-vacuole bodies)"。该亚细胞结构在多种细胞中可见,在细胞器互作网络中起到中心作用,并参与细胞衰老过程。

 

 

 

图3. 同一黑色液泡小体分别协调与线粒体、溶酶体以及脂滴的结合和分离

     图3. 同一黑色液泡小体分别协调与线粒体、溶酶体以及脂滴的结合和分离。

  SR-FACT为研究活细胞三维细胞器互作组学提供了有力工具,也有助于发现在单一成像模态中被忽略的结构或动态。由于低光毒性和无需特异标记的特点,这种成像方法未来预计将在生物学及医学研究中发挥重要作用。这一双模态成像方法在细胞生物学研究及生物医学成像领域有着广泛应用前景。 

       原文链接: https://www.nature.com/articles/s41377-020-0249-4

 

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       细胞迁移参与许多重要的生理和病理活动,微管(microtubules, MTs)依赖的囊泡运输在其中扮演着至关重要的角色。微管可分为锚定于中心体上、对称放射状分布的中心体微管,和稳定于其它亚细胞结构、不对称分布的非中心体微管。高尔基体是非中心体微管起源的主要位置之一。高尔基体关联微管(Golgi-associated microtubules, GaMTs)作为细胞内最主要的非中心体微管,近年来受到广泛关注。然而,GaMTs的特征与功能仍存在诸多未知,这主要是由于中心体附近微管密度极高,传统的成像技术难以直接观察和区分中心体微管与GaMTs。

     近日,孙育杰组在EMBO Reports杂志上发表文章Golgi-associated microtubules are fast cargo tracks and required for persistent cell migration ,通过结合3D-STORM超分辨成像和活细胞单分子追踪技术,首次基于成像方法在细胞间期区分了中心体微管和GaMTs,并系统研究了GaMTs的性质和功能。研究发现,与中心体微管相比,GaMTs具有更少的微管缺陷,这使囊泡在其上运动时会产生较少的停顿或转向;此外,GaMTs的几何学分布更具有极性且指向细胞前缘;且GaMTs的物理性质更稳定。这些特征令GaMTs成为高速公路,使post-Golgi囊泡能够快速到达细胞前缘前缘并促进细胞的持续性迁移。

     首先,作者对细胞中央微管起源区域附近的微管进行3D-STORM成像,在排除了来自离焦层的信号干扰之后,对微管进行了位置相关的分类(GaMTs与non-GaMTs)。接着,结合活细胞单分子追踪技术,研究人员追踪了单根微管上的囊泡运输。有趣的是,研究人员发现在GaMTs上运动的囊泡平均速度更快;相反,non-GaMTs的囊泡则倾向于做小范围的受限运动。随后作者探究了GaMTs介导囊泡更快速运输的可能机制。微管的晶格缺陷可能导致驱动蛋白不能顺利载着囊泡通过而出现停顿或转向事件。作者对比了两种微管的损伤后修复的位点的差异,发现GaMTs比non-GaMTs具有更少的微管缺陷。重要的是,在缺陷位点处囊泡也倾向于产生停顿和转向。这意味着GaMTs上的囊泡将会避免产生停顿和转向,获得更快的平均速度。另外,在几何分布上,GaMTs更加具有极性,且方向指向细胞迁移的前沿;在微管的物理性质上,GaMTs更加能抵御物理化学原因引起的微管解聚。所以,相对于non-GaMTs,GaMTs具有更少缺陷,更有极性,且更稳定,可以帮助囊泡更快的运输到细胞迁移前沿。 

 

 

 

 

 

 

图1:GTP-tubulin perfusion assay标记的微管损伤后修复的位点(黄色),发现GaMTs(红色微管)损伤位点明显少于non-GaMTs(绿色微管)

     接下来,作者深入研究了GaMTs介导囊泡快速运输的生物学意义。作者首先揭示了GaMTs在细胞迁移中的精确功能。利用光遗传学手段,作者通过控制光照的角度和时间把细胞迁移分离成两个独立的事件:转向和持续迁移。研究发现GaMTs仅仅影响细胞的持续迁移过程,而并不影响细胞的方向改变。对细胞迁移中的囊泡运输分析表明:不论是敲低GaMTs还是post-Golgi囊泡E-cadherin的表达量,都造成细胞持续迁移能力显著减弱;而破坏掉GaMTs会导致post-Golgi囊泡无法正常运输至细胞前缘。这说明,囊泡运输到细胞前沿对维持细胞迁移至关重要,而这一过程是依赖GaMTs的。最后,作者进一步探索了哪些类型的囊泡是依赖GaMTs进行运输的,在进行了4种囊泡的研究之后,作者发现GaMTs-依赖的主要是post-Golgi囊泡的运输,而非recycling囊泡。

     图2:GaMTs是囊泡运输的高速公路,且维持细胞持续迁移

     总之,相对于中心体微管,GaMTs具有更少的微管缺陷,更具有几何极性且更稳定,这些特征使得GaMTs 成为囊泡运输到细胞前缘的高速公路,维持细胞的持续性迁移。该研究让人们首次看到了微管拥有不同的运输囊泡的能力。本文也阐述了细胞迁移维持的新机制,这为将来重要的生理病理的研究提供了理论基础。未来,研究两种不同功能的微管的形成机制与调控机制将会非常必要。

原文链接: https://www.embopress.org/doi/pdf/10.15252/embr.201948385

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       应激性是生命的基本特征。响应外界刺激的基因表达调控在细胞水平决定了细胞增殖、分化、迁移和死亡,在器官和生物体水平决定了发育、免疫应答和神经可塑性,其调控异常可能会导致肿瘤。细胞及时响应外界刺激的一个策略是形成转录工厂,即将应答刺激的多个基因和多个RNA聚合酶拉到一起进行高效、协同的转录表达,但是这一过程如何发生和调控尚不清楚。

      孙育杰组4月15日在Science Advances杂志上发表题为Nuclear actin regulates inducibletranscription by enhancing RNA polymerase II clustering 的文章,结合高通量转录组测序和超分辨显微成像,阐明nuclear actin促进转录工厂形成,调控可诱导基因(inducible genes)转录的机理。这个机理可能是基因调控快速响应环境刺激的分子基础。

      核内肌动蛋白(nuclearactin)通过多种途径调控基因表达:1. nuclear actin存在于染色质重构复合物中;2. nuclear actin与三种RNA聚合酶都有相互作用,影响RNA聚合酶的转录活性;3. nuclear actin调控转录辅助因子MAL的活性;4. nuclear actin通过heterogeneous nuclear ribonucleoproteins与nascenttranscript结合;5. nuclear actin影响长程染色质组织结构和DNA损伤修复。尽管有这些研究进展,nuclearactin调控基因表达的机理还不清楚。

       研究人员首先通过RNA-seq确定了在血清刺激条件下差异表达的一类基因—血清响应基因,发现nuclear actin对细胞维持以血清响应基因为特征的转录谱不可或缺。然后研究人员用免疫荧光原位杂交(ImmunoFISH)和多色超分辨成像观察到血清刺激下,Pol II clusters在血清响应基因位点上原位形成,进行活跃转录。接着研究人员通过活细胞超分辨成像、时间相关光激活定位显微(time-correlated PALM)分析、超分辨镶嵌(SR-Tesseler)分析,发现和正常条件相比,Pol II clusters在血清刺激下密度更高、更活跃、持续时间更长(图1),而nuclear actin的存在是观察到这种增强型Pol II clusters的必要条件。进一步,研究人员用多色超分辨成像观察到nuclear actin在血清刺激下会与Pol II clusters共定位,暗示nuclear actin可能作为支架促进形成增强型的Pol II clusters。

图. 活细胞超分辨成像(A),SR-Tesseler分析(B-D),time-correlatedPALM分析(E)

      基于N-WASP蛋白和Arp2/3蛋白复合体都与Pol II有相互作用,研究人员通过超分辨成像与分析,发现经典的N-WASP-Arp2/3-actin pathway是形成血清增强型Pol II clusters的必要条件,而nuclear actin可能通过液-液相分离机制促进Pol II clusters的形成。特别重要的是,除了血清刺激,研究人员发现nuclear actin对在干扰素γ刺激下形成增强型Pol II cluster也是不可或缺的,显示出nuclear actin对调节Pol II clusters和响应刺激下的转录过程具有普遍意义。

     综合上述实验结果,研究人员提出了一个核内肌动蛋白调控转录的模型:核内肌动蛋白作为一个动态支架,通过相分离机制增强转录工厂的形成和维持。同时,这项研究也提出了下一步有待解决的问题。首先,进一步理解核内肌动蛋白如何形成支架、如何与RNA聚合酶共相分离,以此快速形成转录工厂响应不同刺激(血清、干扰素γ),是一个非常有趣的问题。其次,进一步的机理探索在很大程度上将会受益于技术的发展,尤其是发展对核内肌动蛋白进行无假象、高对比度、活细胞成像的技术。

原文链接: https://advances.sciencemag.org/content/6/16/eaay6515

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       磷脂翻转酶(phospholipid flippase)通过水解ATP将磷脂分子从生物膜的胞外侧(包括细胞外侧以及细胞器的囊腔侧)转运到胞浆侧,在维持生物膜的磷脂不对称性分布中发挥重要作用。磷脂翻转酶仅在真核生物中表达,属于P型ATP酶( P-type ATPase )超家族中的成员最多的P4-ATP酶亚家族,与CDC50蛋白家族形成寡聚体发挥功能。

       不同的磷脂翻转酶对底物具有不同的偏好性。与其他P型ATP酶一样,磷脂翻转酶具有三个典型的胞质结构域:核苷酸结合结构域(N结构域,nucleotide binding domain)、磷酸化结构域(P结构域,phosphorylation domain)和执行结构域(A结构域,actuator domain)。其中,N 结构域负责结合ATP并磷酸化邻近P结构域中高度保守的天冬氨酸残基, 而A结构域则负责将磷酸化的天冬氨酸残基去磷酸化。P型ATP酶转运底物的过程被称为Post-Albers循环,存在E1、E1P、E2P和E2四种状态。E1结合ATP后自身磷酸化成为具有较高能量的E1P,E1P会自发地转变为能量较低的E2P,E2P去磷酸化转变为E2,E2又会自发转变为E1开始下一个循环。绝大部分P-型ATP酶为阳离子转运蛋白(例如钙离子泵、钠钾离子泵以及氢离子泵),而磷脂翻转酶P4-ATP酶的转运底物为具有体积巨大、带负电性的磷酸基头部和很长的疏水尾部的磷脂分子。磷脂翻转酶转运底物的具体机制一直是这个领域的热点。

       2019年6月Nature 首先报道了酵母磷脂翻转酶Drs2p-Cdc50p 在抑制、中度活化和完全活化状态下E2P构象的冷冻电镜结构,探讨了Drs2p-Cdc50p的自抑制及PI4P依赖激活的调控机制,并在此基础上提出了一个可能的磷脂进入位点。接着在9月Science报道了人磷脂翻转酶ATP8A1-CDC50a 多个中间状态的冷冻电镜结构(其中在E2Pi-PL结构内部存在一个磷脂分子),然而这些中间状态的跨膜区结构总体保持变化不大。由于以上结构都是在去垢剂环境下获得,而非天然脂双层结构中,因此不能很好地解释磷脂转运的过程。

       2020年4月17日,李龙课题组在Protein & Cell杂志发表题为Structures of a P4-ATPase lipid flippase in lipid bilayers 的研究论文,报道了重建于脂双层中的磷脂翻转酶的高分辨率电镜结构,为磷脂转运的机制提供了新的线索。

      他们利用酵母表达系统表达了嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的磷脂翻转酶ctDnf1p-Cdc50p,并将其重建于模拟磷脂双分子层的nanodisc中,通过添加BeF3-和AMPPCP稳定E2P和E1-ATP构象,利用冷冻电镜单颗粒分析技术获得分辨率分别为3.4 Å和3.5 Å的结构。在结构中存在两个磷脂结合位点,比较两个结构可以发现,跨膜螺旋TM1和TM2表现出高度的灵活性。

      在E2P构象中,靠近胞外侧的磷脂分子所在的位置与Science所报道的E2Pi-PL结构相似,相比而言,磷脂头部更加深入蛋白内部,磷脂尾部弯曲将近90°。而靠近胞浆侧的磷脂分子已经完成了内翻的过程,其头部位于水-膜交界处,尾部的朝向垂直于膜平面。

      比较两个结构可以发现,不仅胞质结构域发生了很大的构象变化,跨膜区结构也有不同。在E1P-ATP构象中,跨膜螺旋TM1的电子密度不可见,表明在磷脂转运的过程中TM1存在高度的灵活性,很可能存在α螺旋与无序结构之间的转变。

     此外,nanodisc的膜结构发生了局部凹陷。在E1P-ATP构象中,局部的膜厚度缩小了将近一半。这一现象也存在于磷脂外翻酶TMEM16F的结构中,很可能是磷脂转运过程中的一种共同机制。

     综上,重建于nanodisc中的蛋白结构更接近磷脂翻转酶的天然状态,包含了新的磷脂结合位点,提供了在去垢剂条件下不能获得的膜-蛋白相互作用的信息,为磷脂转运的具体机制提供了重要的线索。

     原文链接:https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-020-00712-y

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2020年4月8日,清华大学生命学院葛亮课题组在《细胞》(Cell)期刊上在线发表题为“蛋白跨膜转运调节非经典蛋白分泌”(A translocation pathway for vesicle-mediated unconventional protein secretion)的研究论文,首次报道了非经典分泌过程中的蛋白跨膜转位机制。

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学术交流

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 为促进联合实验室之间的学术交流与合作,探讨膜生物学领域的最近研究进展,膜生物学国家重点实验室于2019111日至2日在国科大国际会议中心召开了学术研讨会。中科院动物所、北京大学、清华大学三个分室的学术带头人、博士后以及研究生等一百六十余人出席了会议。

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膜生物学国家重点实验室2018年度学术年会暨学术委员会会议于2019421日在清华大学生命科学馆报告厅顺利召开。科技部基础研究管理中心闫金定处长、北京大学周辉部长、清华大学甄树宁主任等应邀参加会议;同时实验室学术委员、膜室成员等60余人出席了会议。

会议开幕式由实验室学术委员会委员匡廷云院士主持。闫金定处长、周辉部长、甄树宁主任分别致辞,充分肯定了实验室取得的成绩并对实验室发展提出建设性建议:面对国家重大需求,处于国家重点实验室重组重大历史机遇期,实验室如何进一步聚焦、突出原创成果,如何攻克国家行业领域发展战略需求方面中的难题,凝练出实验室未来的研究发展方向。同时预祝年会顺利进行。

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为促 进联合实验室之间的学术交流与合作,探讨膜生物学领域的最近研究进展,膜生物学国家重点实验室于2018119日至10日在国科大国际会议中心召开了学术研讨会。中科院动物所、北京大学、清华大学三个分室的学术带 头人、博士后以及研究生等一百六十余人出席了会议。

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学术报告

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        细胞影像分析技术的日新月异,使得细胞生物学研究在活细胞超高分辩与动态超微结构的研究进入了更新领域,日益成为学术研究与创新研发关注的前沿方向,活细胞超高分辩也在科学研究中发挥了更重要的作用,成为科研工作者有力的工具。

时间:2018年11月30日   (9:30-11:30)

地点:清华大学生物新馆325会议室

主讲人:Lynne Turnbull 

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扫描电镜和透射电镜在生命科学领域起了重要作用,电镜附件的应用也变得愈加重要。本次研讨会着重交流电镜的附件——扫描电镜的冷冻传输系统,透射电镜光电联用系统以及三维重构系统在生命科学中的发展和应用。

会议时间:2018年9月21日(星期五)

会议地点:清华大学生物新馆143会议室签到时间:9:00-9:30

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TGF-β family signaling in physiology and disease

Date: 9月25日(星期一) 10:30

Venue: 清华大学郑裕彤讲堂(理学院报告厅)

Host: Prof.Ye-Guang Chen

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